LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN : Kerja Aseptik, Pembuatan Medium, dan Larutan Pengencer

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN

KERJA ASEPTIK, PEMBUATAN MEDIUM, DAN LARUTAN PENGENCER

Disusun Oleh:

Kelompok 2

Annisatul Nur Jannah

Dwi Febriyani

Kinanty Praha Saputri

Luneta Aurelia Fatma

Jurusan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Industri Pertanian

Universitas Sahid Jakarta

2014

KERJA ASEPTIK, PEMBUATAN MEDIUM, DAN LARUTAN PENGENCER

(PLATE COUNT AGAR)

Tanggal Praktikum : 26 September 2014

A.    TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa dapat dapat melakukan dan menjelaskan hal-hal sebagai berikut :

1.      Bekerja secara aseptik.

2.      Membuat media dan larutan pengencer untuk uji mikrobiologi.

3.      Mempersiapkan peralatan untuk uji mikrobiologi.

4.      Melakukan dekontaminasai alat dan media pasca uji mikrobiologi

B.     TEORI SINGKAT

TEKNIK KERJA ASEPTIK

Teknik aseptik atau steril adalah suatu sistem bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya teknik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. Mikroorganisme dapat juga ”jatuh” dari tangan operator, sarung tangan atau jas laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan teknik aseptik meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya teknik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan, namun semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang ditimbulkan.

Teknik aseptik digunakan pada saat :

1.    Teknik aseptik seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dengan segala media pertumbuhannya.

2.    Teknik  aseptik sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.

3.    Teknik aseptik disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.

4.    Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil yang didapatkan.

5.    Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi. Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.

Aturan umum teknik aseptik:

Ø Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.

Ø Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan. Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit dibersihkan pada sudut-sudut ruang.

Ø Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya. Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.

Ø Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan. Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll) diperiksa terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.

Ø Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler, pipet dll) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri, erlenmeyer dll) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang lapang untuk bekerja.

Ø Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang menempel.

Ø Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang diperlukan beserta cadangannya.

Ø Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.

Ø Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.

Ø Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya dilakukan seperlu mungkin dan bergerak secara lembut.

Ø Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungikn, antar peralatan jangan diletakkan terlalu jauh.

Ø Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi.

Catatan penting dalam kerja aseptik :

Ø Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 45⁰, tujuannya untuk meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu.

Ø Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di atasnya.

Ø Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak lebih dari 6cm.

Ø Tidak boleh menyedot cairan pada saat pipeting dengan mulut.

Ø Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang sebagai limbah berbahaya.

MEDIA/MEDIUM

Media adalah bahan untuk mengembangbiakan mikroba diluar badan manusia atau hewan. Bahan utama media adalah protein yang larut dalam air, misalnya pepton, kasiton, tripton, soyton, sari daging (beef extract/meet extract), sari ragi (yeast extract) dan bahan tambahan lainnya misalnya mineral atau karbohidrat. Untuk media tertentu ada yang memerlukan darah, serum, kuning telur, vitamin, garam, empedu dan lain-lain.

Di perdagangan media dijual dalam bentuk serbuk halus (powder) atau serbuk kasar (granul) kering komponen tunggal atau campuran yang sudah kompak dan serasi. Untuk bisa digunakan tinggal menimbang, menambahkan air, mengemas dan mensterilkan.

Bahkan media yang berbentuk serbuk kering bersifat higroskopik sehingga harus selalu dalam keadaan tertutup dengan rapat.

1.   Syarat media siap pakai

Ø Mengandung zat gizi atau nutrisi

Ø Harus cukup oksigen (untuk bakteri aerob)

Ø Mempunyai kelembapan yang cukup

Ø Mempunyai raksi pH yang cocok

Ø Steril dan terlindung dari pencemaran luar

2.   Sifat fisik media

Ø Media cair (broth), tidak mengandung agar

Ø Media padat (agar), mengandung agar-agar

Ø Media setengah padat (semisolid)

Sebagian bahan pemadat media digunakan agar-agar bubuk. Agar adalah ekstrak dari rumput laut (derivate polisakarida), karbohidrat komplek terdiri dari galaktosa dan tidak mempunyai nilai nutrisi. Untuk media padat kadar agar-agar 1,5-1,8 % , untuk media setengah padat kadar agar-agar 0,4-0,5 % (kurang dari 1%). Untuk media yang bereaksi asam kadar agar-agar dinaikkan lebih dari 2 %.

        Media siap pakai bisa disimpan di lemari pendingin pada suhu antara 4-5^oC. Untuk media agar cawan yang basah perlu dikeringkan dulu dalam inkubator. Media yang paling sering digunakan adalah media tabung agar miring, media tabung agar tegak dan media cawan dalam cawan petri (identifikasi bakteri).

3.   Macam-macam media dan gunanya

1.      Media Sederhana

Media ini berguna untuk menumbuhkan bakteri secara umum. Contohnya : air pepton, nutrient broth, nutrient agar. Jenis media ini biasa digunakan juga sebagai dasar dalam pembuatan media yang lebih kompleks.

2.      Media diperkaya (Enriched media)

Berguna untuk menumbuhkan bakteri atau mikroba yang memerlukan zat gizi yang tinggi misalnya media agar darah, Lowenstein Jensen (mengandung kuning telur) Loefflers (mengandung serum kuda), Bordet-gengou (mengandung darah dan gliserol),

3.      Media selektif

Adalah media yang berguna untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri tertentu misalnya Mac Conkey Agar. Endo Agar, SS Agar, Brilliant Green Agar (untuk Enterobacteria), Selenit Cystine Broth (untuk Salmonella), Saborauds Medium (untuk Jamur dan Ragi), Tellurit Medium (untuk Corynebacteria).

4.      Media Karbohidrat dan biokimia lainnya

Media ini berguna untuk mengidentifikasinya bakteri menurut kemampuannya dalam mengolah karbohidrat atau lainnya hingga dapat membedakan antara satu jenis bakteri dengan jenis lainnya misalnya : Lactose Broth, Glucose Broth, Tryptone Broth, Simmons Citrate Agar.

5.      Media Transport

Media ini berguna untuk mengangkat specimen bahan tertentu hingga kandungan mikrobanya tidak mudah terganggu oleh kondisi lingkungannya misalnya media Buffered Saline Glycerol (untuk specimen feses/mengandung Salmonella atau Shigella), Stuart Transport Medium (untuk specimen anaerob gonococcus).

6.      Media Assay

Berguna untuk menguji potensi antibiotika dan vitamin.

Contoh : Antibiotik medium 1-20, Vitamin Assay Medium.

Bentuk dan jumlah media

Jumlah media yang akan digunakan di dalam suatu percobaan harus diperhitungkan sedemikian rupa untuk menghindari pembuatan media yang berlebihan karena mahal harganya.jumlah media yang digunakan dapat ditentukan berdasarkan bentuk meda yang di gunakan dan jumlah pekerjaan contoh sbb:

·      Agar cawan                                    :15-20ml/cawan petri

·      Agar tegak                                      :8-9ml/tabung reaksi

·      Agar miring                                    :6-7ml/tabung reaksi

·      Media cair                                       :9-10ml/tabung reaksi

·      Media cair berisi tabung durham    :9ml/tabung reaksi

LARUTAN PENGENCER

            Larutan pengencer/larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Seperti halnya medium, larutan pengencer yang digunakan untuk mengencerkan contoh biasanya mengandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Buffer yang biasa digunakan dalam pembuata medium dan larutan pengencer adalah fosfat, karena satu-satunya komponen anorganik yang mempunyai sifat buffer pada kisaran pH normal, yaitu kisaran pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi dari mikroba. Fosfat juga tidak bersifat racun pada mikroba dan dapat merupakan sumber fosfor untuk pertumbuhan mikroba. Garam fosfat yang sering digunakan untuk buffer adalah K₂HPO4 _­(kalium monohidrogen fosfat) atau KH₂PO₄ (kalium dihidrogen fosfat). Sebagai larutan pengencer, selain larutan yang mengandung buffer fosfat dapat juga digunakan untuk larutan garam fisiologi (0,85%) atau larutan Ringer. Larutan pengencer dapat ditempatkan didalam tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceraran 1:10  dan 1:100 .

C. ALAT DAN BAHAN

·         Alat :

-          Tabung Erlenmeyer

-          Autoclave

-          Hot Plate

-          Pengaduk

-          Spatula

-          Cawan

·         Bahan :

-          Plate Count Agar (PCA)

-          Kapas

-          Alumunium Foil

D. CARA KERJA

1.      Timbanglah sejumlah medium dengan menggunakan spatula sesuai volume agar yang ditentukan sesuai yang ditertera pada kemasan, dan larutkan kedalam air destilata sebanyak volume yang ditetapkan, di dalam tabung Erlenmeyer.

2.      Kemudian lakukan pemanasan untuk melarutkan agar. Aduk dengan batang gelas selama pemanasan atau dengan pengaduk magnit jika pemanasan dilakukan diatas hot plate agar pada bagian bawah tabung tidak hangus. Hingga warnanya jernih.

3.      Siapkan penutup untuk tabung erlenmeyer. Bungkus kapas dengan alumunium foil sesuai dengan ukuran tabung erlenmeyer.

4.      Setelah larutan berwarna jernih tutup dengan penutup yang sudah di buat.

5.      Lalu lakukan sterilisasi. Sterillisasi dilakukan di dalam autoclave pada suhu 121°C (15 lb) selama 15 menit.

E.     PERHITUNGAN

Plate Count Agar

2 buah erlenmeyer x 30ml air destilata = 60 ml

60ml x 5 = 300ml/1000 x 39 = 11.7gr

F.     DATA PENGAMATAN

Pembuatan Plate Count Agar

Timbang media plate count agar sebanyak 4,7 gram. Masukkan ke dalam erlenmayer. Larutkan media plate count agar dengan air destilata sebanyak 200 ml. Panaskan diatas penangas air hingga warna kuning jernih. Setelah media jernih, tutup elenmayer menggunakan tutup kassa dan alumunium foil. Masukkan kedalam autoclave untuk di sterilisasi pada suhu 121^oC selama 15 menit.

Sterilisasi Alat

Ambil cawan petri sebanyak 6 buah. Pisahkan cawan petri menjadi 2 bagian. Bungkus cawan petri menggunakan koran dengan keadaan dibalik. Sterilisasi alat dengan menggunakan sterilisasi kering yaitu oven dengan suhu 170^o-180^oC selama 2 jam.

Hasil

Nama : Plate Count Agar

Warna sebelum pengadukan : Kuning keruh

Warna sesudah pengadukan : Kuning jernih

Fungsi : Menghitung jumlah mikroorganisme, merupakan pertumbuhan umum.

CARA PENGGUNAAN AUTOCLAVE

1.      Colokan autoclave ke panel listrik.

2.      Nyalakan tombol ON.

3.      Tutup keran yang berada di bawah panic otoklaf agar air tidak keluar.

4.      Isi air sampai batas yang telah ditentukan di dalam panic autoclave.

5.      Biarkan ± 10 menit agar autoclave panas.

6.      Masukkan media yang akan di steril kedalam keranjang lalu masukkan kedalam autoclave.

7.      Kencangkan baut-baut  yang ada disekeiling penutup autoclave.

8.      Geser bandul besi yang berada diatas tutup autoclave sampai keujung besi sehingga tidak ada uap air yang keluar.

9.      Tunggu sampai 1 atm ± 30 menit.

10.  Setelah tekanan 1 atm geser bandul besi sampai ketengah sehingga ada uap air yang keluar.

11.  Tunggu selama 15 menit.

12.  Setelah 15 menit geser bandul sampai posisi besi bandul berdiri, sehingga banyak uap air yang keluar.

13.  Tunggu hingga tekanan turun 1 atm hingga nol.

14.  Setelah sampai nol buka baut-baut yang ada di sekeliling autoclave tadi dikencangkan

15.  Posisi badan saat membuka tutup autoclave yaitu berada di belakang autoclave atau berada dibelakang tutup auttoclave.

16.  Matikan tombol OFF

17.  Buka kran ang berada di bawah agar air bisa keluar.

18.  Keluarkan keranjang yang berisi media.

19.  Cabut colokan autoclave dari panel listrik.

G.    PEMBAHASAN

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Media juga merupakan makanan atau campuran dari beberapa bahan makanan yang disiapkan untuk pertumbuhan mikroorganisme. Media dapat digunakan untuk isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh dengan baik.

Sterilisasi adalah proses atau kerja untuk membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan mikroba atau peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan. Untuk sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, biasanya yang digunakan adalah pemanasan kering yaitu menggunakan oven sebagai alat sterilisasinya, dimana dengan menggunakan suatu siklus oven modern yang dilengkapi udara yang dipanaskan dan disaring. Selain menggunakan oven, pemanasan kering juga bisa menggunakan alat yang disebut bunsen dan spiritus, dimana alat ini biasanya untuk mensterilisasi jarum ose yang akan digunakan pada proses inokulasi mikroba. Sedangkan pada pemanasan basah yaitu menggunakanalat yang disebut autoclave, dimana alat ataupun bahan yang akan disterilisasiakan dipanaskan dengan suhu 121^oC, dengan tekanan 1-2 atm, selama 15 menit.

H.    KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan dari praktikum ini, maka diperoleh beberapa kesimpulan sebagai berikut:

1.      Fungsi Plate Count Agar (PCA) adalah menghitung jumlah mikroorganisme, merupakan pertumbuhan umum.

2.      Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba.

3.      Sterilisasi adalah proses atau kerja untuk membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan mikroba atau peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan.

4.      Sterilisasi pada pemanasan kering menggunakan alat yang disebut bunsen dan spiritus, dimana alat ini biasanya untuk mensterilisasi jarum ose yang akan digunakan pada proses inokulasi mikroba.

5.      Seterilisasi pada pemanasan basah menggunakan alat yang disebut autoclave.

6.      Alat ataupun bahan yang akan disterilisasiakan dengan autoclave dipanaskan dengan suhu 121^oC, dengan tekanan 1-2 atm, selama 15 menit.

SARAN

Dalam praktikum mikrobiologi pangan ini, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan agar praktikum dapat berjalan dengan baik terutama mengenai jumlah alat yang digunakan. Praktikan disediakan waktu lebih banyak lagi agar dapat mengamati objek lebih teliti lagi. Sebelum praktikum lakukan pengecekan alat yang akan digunakan terlebih dahulu.

DAFTAR PUSTAKA

B.     Buku-buku

Widodo, Julius. E. 2011. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Jakarta : SMK Caraka Nusantara.

Deroza, Allen. 2014. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Universitas Sahid.

C.    Online [30 September 2014]

http://blogkita.info/pembuatan-media-n-sterilisasi/

http://www.scribd.com/doc/39590242/Pembuatan-Medium-Agar-Miring-5

http://nurulagustinac.wordpress.com/2013/04/22/persiapan-media-larutan-pengencer-dan-kerja-aseptik/

GLOSARIUM

Ø  Aerob : Kondisi tersedia oksigen.

Ø  Aseptik : Keadaan bebas dari mikroorganisme penyebab penyakit.

Ø  Autoclave : Alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121⁰C, 15 lbs).

Ø  Bakteri : Mikroorganisme bersel tunggal yang tidak memiliki inti sel sejati.

Ø  Buffer : Larutan yang digunakan untuk mempertahankan nilai pH tertentu agar tidak banyak berubah selama reaksi kimia berlangsung.

Ø  Ekstrak : Sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai

Ø  Higroskopis : Kemampuan suatu zat untuk menyerap molekul air dari lingkungannya baik melalui absorbsi atau adsorpsi.

Ø  Inokulasi : Memindahkan mikroorganisme dari medium lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi.

Ø  Kontaminiasi : Pengotoran; pencemaran karena kemasukan unsur luar.

Ø  Mikroba / Mikroorganisme : Organisme yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop.

Ø  PCA : Plate Count Agar, medium pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan untuk menilai atau memonitor"total" atau layak pertumbuhan bakteri dari sampel.

LAMPIRAN